今日《細(xì)胞》：重磅基因編輯工具誕生！吹散“最后一片烏云”

4月26日，一篇在線(xiàn)發(fā)表于《細(xì)胞》雜志的論文介紹了一項(xiàng)重要突破：來(lái)自韓國(guó)的研究團(tuán)隊(duì)首次在線(xiàn)粒體DNA中實(shí)現(xiàn)A堿基到G堿基的轉(zhuǎn)換，為基因編輯技術(shù)填補(bǔ)上一塊至關(guān)重要的拼圖，也帶來(lái)了治愈多種線(xiàn)粒體遺傳病的希望。

從上世紀(jì)60年代首次發(fā)現(xiàn)限制性?xún)?nèi)切酶，到1985年發(fā)明PCR技術(shù)，再到最近十年CRISPR技術(shù)誕生、用于活體生物的基因編輯，短短半個(gè)世紀(jì)，人類(lèi)在一次又一次的突破中實(shí)現(xiàn)了操縱DNA能力的巨大飛躍。其中，CRISPR的出現(xiàn)更是讓科學(xué)家能高效編輯基因組中的致病突變，為眾多遺傳病提供全新的治療方案。

不過(guò)，還有一朵烏云長(zhǎng)期籠罩在基因編輯領(lǐng)域的上空，這就是線(xiàn)粒體DNA的編輯。

作為參與能量代謝的重要細(xì)胞器，線(xiàn)粒體中也含有少量來(lái)自母系的DNA。如果這部分基因發(fā)生突變，則可能導(dǎo)致多種與代謝相關(guān)的遺傳疾病。

例如，Leber遺傳性視神經(jīng)病變（LHON）可能導(dǎo)致患者失明，這種兇險(xiǎn)的疾病就是由線(xiàn)粒體DNA的點(diǎn)突變導(dǎo)致的。線(xiàn)粒體DNA突變還可能導(dǎo)致某些線(xiàn)粒體腦肌病，患者的大腦遭受損傷，可能出現(xiàn)癲癇、精神行為異常等癥狀。平均每5000個(gè)人里，就有一個(gè)人患上線(xiàn)粒體點(diǎn)突變導(dǎo)致的遺傳病。

盡管基因編輯工具最近十年迎來(lái)爆發(fā)式發(fā)展，但面對(duì)線(xiàn)粒體遺傳病時(shí)，這些工具卻總是難以奏效。例如，當(dāng)下最為盛行的CRISPR-Cas系統(tǒng)就因?yàn)橄驅(qū)NA不能穿越線(xiàn)粒體膜，因而無(wú)法用于治療線(xiàn)粒體疾病。

線(xiàn)粒體DNA的編輯，可以說(shuō)是基因編輯領(lǐng)域最后一塊未經(jīng)涉足的土地，而這個(gè)難題也成為治愈多種遺傳疾病必須跨越的障礙。

2020年，一項(xiàng)革命性的突破到來(lái)。Broad研究所的劉如謙教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一款名為DdCBE的基因編輯工具，可以直接修改雙鏈DNA上的堿基，實(shí)現(xiàn)從C堿基到T堿基的轉(zhuǎn)換，這也是科學(xué)家首次在人體細(xì)胞中進(jìn)行線(xiàn)粒體DNA的編輯。

不過(guò)，作為線(xiàn)粒體DNA編輯的開(kāi)拓性成果，DaCBE也有不足之處：其只能高效地進(jìn)行TC-TT序列的轉(zhuǎn)換，在90個(gè)已知的致病線(xiàn)粒體突變位點(diǎn)中，只有9個(gè)能得到修復(fù)。

而在這90個(gè)突變位點(diǎn)中，有多達(dá)39個(gè)都可以通過(guò)A-G堿基的轉(zhuǎn)換來(lái)修復(fù)。如果能找到實(shí)現(xiàn)A-G轉(zhuǎn)換的手段，那么包括上述兩種疾病在內(nèi)，多種線(xiàn)粒體遺傳病都有望迎來(lái)治愈的方法。

在這項(xiàng)發(fā)表于《細(xì)胞》的最新研究中，來(lái)自韓國(guó)基礎(chǔ)科學(xué)研究所基因編輯中心的研究團(tuán)隊(duì)終于完成了這項(xiàng)“不可能的任務(wù)”，他們開(kāi)發(fā)出一款全新的基因編輯平臺(tái)，命名為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物相關(guān)脫氫酶（transcription activator-like effector-linked deaminases，簡(jiǎn)稱(chēng)TALED）。

▲TALED編輯線(xiàn)粒體DNA的示意圖（圖片來(lái)源：參考資料[1]）

TALED到底是什么？接下來(lái)我們將看到，TALED由3個(gè)功能各異的主要部分組成，它們環(huán)環(huán)相扣、共同協(xié)作，最終完成這項(xiàng)基因編輯任務(wù)。

第一個(gè)部分，可以看作TALED的向?qū)АＧ懊嬲f(shuō)到，常見(jiàn)的基因編輯系統(tǒng)無(wú)法進(jìn)入線(xiàn)粒體。為了解決這個(gè)問(wèn)題，TALED與劉如謙團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的DaCBE一樣，使用了轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（TALE）。作為一種DNA結(jié)合蛋白，TALE蛋白能夠靶向特異的DNA序列，其在線(xiàn)粒體靶向序列（MTS）的引導(dǎo)下進(jìn)入線(xiàn)粒體，并且與特定的線(xiàn)粒體DNA序列結(jié)合。

到這里，TALED就被帶到了工作場(chǎng)所。在這里，輪到TALED的第二個(gè)部分登場(chǎng)。研究團(tuán)隊(duì)需要找到合適的脫氫酶，在這里實(shí)現(xiàn)A-G堿基的轉(zhuǎn)換。為此，他們選擇是名為T(mén)adA8e的腺嘌呤脫氫酶，其由大腸桿菌的腺嘌呤脫氫酶改造而來(lái)。

這個(gè)選擇頗具創(chuàng)意，因?yàn)門(mén)adA8e被認(rèn)為是一種專(zhuān)門(mén)對(duì)單鏈DNA起作用的蛋白，但在這里，它需要在線(xiàn)粒體的雙鏈DNA中進(jìn)行堿基編輯。

這篇論文的通訊作者，基因編輯中心主任KIM Jin-Soo教授說(shuō)：“沒(méi)有人想過(guò)用TadA8e在線(xiàn)粒體中進(jìn)行堿基編輯，因?yàn)樗徽J(rèn)為只對(duì)單鏈DNA起作用。正是這個(gè)跳出傳統(tǒng)框架的想法，幫助我們發(fā)明了TALED。”

而幫助TadA8e做到這一點(diǎn)的，是TALED的最后一個(gè)主要部分：胞嘧啶脫氫酶DddAtox。DddAtox使得雙鏈DNA可以短暫地解開(kāi)，而TadA8e正是抓住了這個(gè)轉(zhuǎn)瞬即逝的時(shí)間窗口，在人類(lèi)細(xì)胞的線(xiàn)粒體中高效催化A-G堿基的轉(zhuǎn)換，編輯頻率可高達(dá)49%。

▲TALED實(shí)現(xiàn)了A-G堿基的轉(zhuǎn)換（圖片來(lái)源：參考資料[1]）

通過(guò)對(duì)TALED的調(diào)整，研究團(tuán)隊(duì)分別開(kāi)發(fā)出能同時(shí)實(shí)現(xiàn)A-G以及C-T堿基轉(zhuǎn)換的技術(shù)，以及僅進(jìn)行A-G轉(zhuǎn)換的技術(shù)。

當(dāng)然，作為一項(xiàng)開(kāi)創(chuàng)性的技術(shù)，TALED仍有不完美之處，例如在進(jìn)行堿基編輯時(shí)，可能會(huì)造成與目標(biāo)位點(diǎn)相鄰的核苷酸也發(fā)生轉(zhuǎn)換；此外，TALED是否會(huì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生脫靶效應(yīng)也有待觀(guān)察。

但毫無(wú)疑問(wèn)，TALED技術(shù)的出現(xiàn)讓我們又多了一種極具潛力的基因編輯工具，吹散基因編輯最后的烏云。展望這項(xiàng)技術(shù)的未來(lái)應(yīng)用場(chǎng)景，研究團(tuán)隊(duì)希望能提升TALED的編輯效率與特異性，最終能夠分別在胚胎、新生兒與成年患者體內(nèi)修正致病的線(xiàn)粒體突變。我們期待，那些受困于線(xiàn)粒體遺傳病的人們終將迎來(lái)治愈的一刻。

參考資料：

[1] Sung-Ik Cho, Seonghyun Lee, Young Geun Mok, Kayeong Lim, Jaesuk Lee, Ji Min Lee, Eugene Chung, Jin-Soo Kim. (2022). Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.03.039

[2] A new era of mitochondrial genome editing has begun. Retrieved Apr 25th, 2022 from https://www.eurekalert.org/news-releases/950486